Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов.

Выделяются следующие виды микроскопии:

1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм);

2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм);

3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур);

4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах);

5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур);

6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов;

7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов);

8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1 – 0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии – просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур.

Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных.

Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах.

Метод культуры клеток – это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Метод витального окрашивания – введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками – макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель.

Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген – антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации.

Метод дифференциального центрифугирования – изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Методы морфометрии – количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра – кариометрия, клеток – цитометрия, органелл – электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях.

Различные экспериментальные методы – пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито– и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях.

Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.

Взятие материала

– кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:

1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;

2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;

4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.

Фиксация материала

Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.

Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды

(парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез.

Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей

После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование

(для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители.

Просветление срезов в ксилоле и толуоле

Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом.

После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.

Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.

Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.

Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.

Данный метод является основным, или классическим. Для их изготовления объект исследования прогружают в фиксирующие жидкости, которые денатурируют белки и стабилизируют определенные структуры и соединения, подлежащие исследованию. Наиболее распространенным фиксатором является формалин. Он сшивает белки метиленовыми мостиками, вызывая их денатурацию. После фиксирования и промывания в воде объект исследования можно резать на тонкие пластинки, предварительно заморозив его на специальном замораживающем микротоме — приборе, при помощи которого изготовляют гистологические срезы. Для замораживания объекта чаще всего используют жидкий углекислый газ либо электрозамораживающую установку. Однако при таком методе обработки материала получают довольно толстые гистологические срезы. Для изготовления более тонких срезов, толщиной до 2 мкм, объект исследования необходимо пропитать веществом, которое сделало бы его более плотным. Такими веществами являются парафин, желатин и целлоидин. Объект после фиксирования и промывания погружают последовательно в спирты возрастающей концентрации — от 50 до 100 градусов для его обезвоживания и пропитывают желатиной, парафином или целлоидином. После пропитывания и уплотнения объекта его можно резать на микротоме.
Гистологические срезы затем окрашивают специально подобранными красителями, большинство из которых избирательно окрашивает структурные компоненты клеток и тканей. Все красители можно разделить на три группы:

щелочные , или ядерные. Ими окрашивают ядра клеток и некоторые другие структуры, имеющие кислую реакцию, например эндоплазматическую сеть. Примером щелочных красителей могут быть гематоксилин, кармин, сафранин;

кислые , или цитоплазматические, которыми окрашивают цитоплазму клеток. Наиболее распространенными кислыми красителями являются эозин, пикриновая кислота, кислый фуксин, индигокармин;

специального назначения — избирательно окрашивают структурные компоненты клеток либо вещества определенной химической природы. Наиболее распространенными красителями специального назначения являются судан III, осмиеловая кислота, окрашивающая жиры и жироподобные вещества; орсеин, окрашивающий эластин.
После окрашивания гистологические срезы быстро обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле или толуоле, переносят на предметное стекло, заливают тонким слоем канадского бальзами или полистирола и накрывают покровным стеклом. Бальзам, полистирол и стекло имеют одинаковый показатель преломления света, и лучи света минимально рассеиваются, проходя через препарат.

Методы гистологического исследования. Современная гистология имеет широкий арсенал разнообразных методов исследования. Все эти методы объединяет требование применения специального прибора - микроскопа, и поэтому все они микроскопическими методами.

Зависимости от состояния исследуемого объекта эти методы разделяют на гостиной (или Суправитальное), когда изучаются живые клетки, ткани, органы и даже целые организмы, и поствитальни, когда исследуют мертвые фиксированные объекты.

Становление поствитального метода, или метода изготовления постоянного гистологического препарата, происходило параллельно со становлением самой науки гистологии во второй половине XIX в. Его называют еще методом классической гистологии. Этот метод, называется гистологической или микроскопической техники, требует достаточно сложной подготовки объекта исследования. Последняя является предметом для написания специальных, достаточно больших по объему пособий. Студенту, который начинает изучать гистологию, необходимо ознакомиться с основами техники изготовления гистологических препаратов, для того чтобы лучше понять эти препараты и научиться анализировать, "читать", ибо именно постоянные гистологические препараты широко используются как в учебном процессе, так и в научных исследованиях.

Первый этап при изготовлении препарата - получение материала. Уже на этом этапе, как и на всех последующих, следует избегать излишнего травмирования объекта. Поэтому, вырезая кусочек органа или ткани, надо брать острые ножницы или лезвие, не сжимать ткань пинцетом. Кусочки берутся небольших размеров - около 1 см3 (лучше 7x7x3 мм). Материал должен быть свежим, принимать его нужно как можно скорее после забивки экспериментального животного или смерти человека.

Следующий этап - фиксация материала, осуществляется путем погружения взятого кусочка в фиксирующие жидкости. Целью этого этапа является закрепление гистологических структур и макромолекул в том месте и состоянии, в котором они были в живом объекте. Конечно фиксаторы обусловливают определенные изменения прижизненного состояния структур, но можно подбором специальных фиксировали-ных агентов свести эти изменения к минимуму. Фиксаторами служат спирты (этиловый, метиловый), растворы формалина, соли тяжелых металлов, кислоты (уксусная, пикриновая, осмиевая). Чаще применяются различные сложные фиксирующие смеси, включающие названные компоненты в различных соотношениях.

Третий этап - обезвоживание фиксированного материала. Для этого используют спирты различных концентраций, постепенно возрастают от 50-70 до 100 градусов. Обезвоживание необходимо для следующего этапа - уплотнение объекта, осуществляется в парафине, целоидини, синтетических смолах. Подавляющее большинство этих веществ с водой не смешивается, и поэтому для пропитки ими материала необходимо тщательно удалить воду из ткани, а затем пропитать ее ксилолом (толуолом, бензолом), то есть веществом, хорошо растворяет парафин, а также смешивается со 100-градусным этиловым спиртом. После пропитки объекта жидким парафином при температуре 55-5б ° С ему дают затверднуты при комнатной температуре вместе с парафином в специальных формочках. Так получают парафиновый блок. Эта процедура называется заливкой. Ускоренное уплотнение достигается путем замораживания кусочков ткани сухим льдом (двуокисью углерода) или жидким азотом, однако структура исследуемых гистологических объектов сохраняется в таком случае хуже.

Уплотнение материала позволяет изготовить из него тонкие (толщиной 5-7 мкм), пивтонки (0,5-1 мкм) срезы, используемые для световой микроскопии, для электронной микроскопии используют ультратонкие срезы (0,05-0,2 мкм). Изготовление срезов проводят на специальных приборах-микротомы (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии). Тонкий, пивтонкий или ультратонкий срезы являются прозрачными для световых лучей или пучка электронов объектами и дают возможность изучения их под соответствующими микроскопами. Для того, чтобы различать структурные детали объекта, большинство которых не имеют естественного контраста, полученный срез надо красить (для изучения под световым микроскопом) или контрастировать (для электронной микроскопии).

В гистологии существует много методов окраски препаратов и применяется много различных красителей зависимости от цели исследования. Гистологические красители по происхождению делятся на растительные, животные и синтетические (анилиновые). Примером растительных красителей является гематоксилин, получаемый из коры кампешевого дерева, растущего в Центральной Америке, а животных кармин, который получают из насекомых - кошенили. Абсолютное большинство красителей являются синтетическими - эозин, фуксин, азур т.д..

Важнейшей является классификация гистологических красителей по химическим свойствам, поскольку на ней основывается ряд понятий и терминов, которые будут встречаться на протяжении всего курса. Итак, по химическим свойствам гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. Свойства кислых красителей оговариваются группами-СООН,-HS03,-Н2Р03, это так называемые анионные красители. Кислые красители окрашивают цитоплазму клетки, их называют цитоплазматическими. Примером таких красителей могут быть эозин (дает ярко-розовый цвет), светлый зеленый (дает зеленый цвет). Гистологические структуры, способные закрашиваться кислыми красителями, называют оксифильных (ацидофильными, эозинофильными). Это, например, цитоплазматические гранулы эозинофильных лейкоцитов, коллагеновые волокна и т.п..

Основные красители являются катионными, подавляющее большинство их в составе молекулы должно положительно заряженные атомы азота. Названы красители избирательно окрашивают ядра клеток и поэтому их называют ядерными. Примером могут служить гематоксилин (красит в сине-фиолетовый цвет), кармин (в светло-красный), сафранин (темно-красный), азур II (в синий). Гистологические структуры, способные закрашиваться основными красителями, называют базофильными. Это гранулы в цитоплазме базофильных лейкоцитов, ядра клеток и т.п..

Нейтральные красители образуются в случае сообщения водных растворов кислого и основного красителей, например, еозиново-кислый метиленовый синий. Кроме того, следует различать нейтральные красящие смеси, когда в растворе одновременно имеются основной и кислый красители. Структуры, которые одновременно воспринимают и основные и кислые красители, называют нейтро профильной-ми, или полихроматофильнимы. Примером могут служить гранулы нейтро профильных лейкоцитов, цитоплазма полихроматофильних эритро-бластов т.д.. Способность гистологических структур менять цвет основного красителя обозначается термином метахромазии. Метахроматические окрашивается зернистость базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хрящевой ткани и т.д.. Препараты обычно красят, сочетая один кислый и один основной краситель, что позволяет выявить ядро, цитоплазму и все базофильные и оксифильные структуры. Одними из наиболее часто объединяемых красителей является гематоксилин и эозин.

Кроме кислых, основных и нейтральных красителей существуют специальные, используемые для выявления определенных веществ или структур. Например, судан III окрашивает жировые вещества в оранжевый цвет, а орсеином - эластичные волокна в бурый.

Крашеные препараты обычно обезвоживает в спиртах, просвещают в ксилоле и заливая тонким слоем канадского бальзама, накрывают покровным стеклом. После высыхания бальзама получают постоянный препарат, которым можно пользоваться в течение длительного времени. Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротомах, размещают на специальных сеточках, контрастируют солями урана или свинца, просматривают через микроскоп и фотографируют. Полученные микрофотографии являются объектом изучения одновременно с гистологическими препаратами.

Кроме описанных тонких срезов есть еще другие виды гистологических препаратов, которые используют значительно реже, лишь в отдельных случаях. К ним относятся мазки (крови, костного мозга, слюны и т.д.), отпечатки (печени, тимуса, слизистой оболочки мочевого пузыря), пленки (соединительной ткани, плевры, брюшины, мягкой мозговой оболочки), тотальные препараты (зародыши ранних стадий развития, половые клетки).

Гостиные (прижизненные) методы исследования клеток или тканей дают возможность получить информацию о том, как в них происходят процессы жизнедеятельности, проследить движение, разделение, рост, взаимодействие клеток, их реакцию на действие различных факторов. Прижизненные методы исследования - необходимое дополнение к тем данным, которые получены методом классической гистологии о строении клеток, тканей. Прижизненные исследования проводят в живом организме, то есть in vivo. Для исследования живых клеток используют методы поздравительное и Суправитальное окраску. Для этого применяют специальные, не токсичны для живых тканей, красители. При поздравительное окраски краситель вводят в организм живого животного и он избирательно окрашивает определенные клетки. Так исследуют клетки макрофагичнои системы при условии введения трипанового синего или литиевого кармина. Суправиталь-не окраска - это окраска живых клеток, изолированные из организма. Так обнаруживают лизосомы (краситель нейтральный красный), митохондрии (Янус зеленый), ретикулоциты крови (бриллиант-крезиловий синий).

Для поздравительного или Суправитальное, а также поствитального исследований неокрашенные гистологических объектов используют ряд специальных методов световой микроскопии - фазоконтрастну, темнопольову, флуоресцентную.

Метод фазового контраста обеспечивает необходимую контрастность исследуемых неокрашенные структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещается в конденсор, и так называемой фазовой пластинки, содержащейся в объективе. Такая конструкция оптики светового микроскопа позволяет преобразовывать фазовые изменения света, проходящего через объект, в амплитудные, которые замечает глаз как изменения яркости.

Сегодня уже невозможно себе представить полноценное лечение злокачественного образования без гистологического исследования. Вместе с тем мало кто имеет четкое представление о таком методе диагностики. В статье расскажем о том, как осуществляется проведение гистологического исследования, и о том, зачем оно необходимо. Также поговорим об использовании диагностики такого рода в гинекологии.

Что собой представляет

Гистологический метод исследования заключается в изучении внутренних тканей организма больного, которые берутся в виде маленького образца. Зачастую материал получают посредством биопсии. В диагностике раковых опухолей и оценке правильности медикаментозной терапии гистологическое исследование - один из самых важных этапов.

Цели проведения

Такая диагностика проводится для уточнения или подтверждения ранее поставленного диагноза. Также она помогает верно определить заболевание в спорных ситуациях. Гистологическое исследование материала больного дает возможность на ранней стадии выявить наличие злокачественного образования, изучить динамику его роста (определить, есть ли разрастание, увеличение, распространение опухоли). Кроме того, с помощью него осуществляют дифференциальную диагностику патологических процессов и анализируют изменения, происходящие в ходе лечения в тканях.

Значение в медицине

В настоящее время перед проведением химиотерапевтического или лучевого лечения больных со злокачественными образованиями обязательно назначается гистологическое исследование опухоли. Также без него не проводится ни одна хирургическая операция, связанная с онкологией. Помимо этого, тщательное изучение тканей пациентов нужно для того, чтобы вовремя обнаружить даже малейшие изменения в опухолевом процессе и своевременно принять меры.

Но в лечении не только раковых больных используется гистологическое исследование. Биопсия крайне важна при выборе оптимальной лечебной программы для пациентов с заболеваниями, изучением которых занимаются такие отрасли и разделы медицины, как гинекология, гастроэнтерология, урология, пульмонология, оториноларингология, гематология, нефрология, торакальная и абдоминальная хирургия и др.

Выполнение забора материала

Необходимый для осуществления исследования материал можно получить из любых тканей и внутренних органов пациента. Сегодня имеется много способов произвести данную процедуру:

• Иссечение необходимого количества тканей в процессе хирургической операции (эксцизионная биопсия).
• Прокол полости пораженного органа или злокачественного опухолевого образования при помощи специальной длинной иглы. Такие иглы представлены в различных конструкциях и видах. Посредством пункционной биопсии проводится, к примеру, гистологическое исследование печени.
• Вырезание или отрезание из удаленных внутренних органов небольших кусочков ткани.
• Скусывание специальными щипцами нужного количества ткани при выполнении эндоскопических манипуляций: колоноскопии, бронхоскопии, эзофагогастродуоденоскопии. Такой способ носит название щипцовой биопсии.
• Отсасывание небольшого количества материала из полых внутренних органов (аспирационная биопсия).
• Кюретаж внутренних стенок патологических и естественных полостей. Таким способом проводят, например, гистологическое исследование шейки матки и остеомиелитической полости.

Особенности процедуры

Чтобы получить наиболее достоверные и правильные результаты, необходимо строго выполнять правила забора биологического материала. Образцы ткани, как уже говорилось, можно взять в ходе хирургической операции, когда, к примеру, удаляют часть органа или его целиком, или же в результате биопсии. Большинство врачей предпочитают вторую методику забора материала, она является гораздо более распространенной.

Гистологическое исследование может осуществляться посредством изучения как целого опухолевого образования, так и небольшого столбика ткани. Часто биопсию выполняют с помощью очень длинной и тонкой иглы, которая предназначена для внутримышечных инъекций. Но в отдельных случаях применяют иглу большего диаметра - это делает процедуру более болезненной, но и более эффективной, поскольку специалисты получают возможность провести еще и иммуногистохимический анализ.

Методы диагностики

Есть два методы выполнения гистологического исследования - традиционный и ускоренный. В первом случае полученные образцы ткани сначала заливают расплавленным парафином, а потом нарезают на пластины толщиной 1-8 мкм и подвергают окрашиванию. При применении такого способа данные анализа будут готовы через пять-десять дней.

При использовании ускоренной методики результат гистологического исследования может быть получен в течение часа. В этом случае биологический материал, взятый у пациента, экстренно замораживают, а затем делают в нем послойные тончайшие разрезы и внимательно изучают под микроскопом. Такой метод незаменим, когда хирургу при выполнении операции нужно срочно принять решение относительно того, удалять орган больного или сохранять.

Если гистологическое исследование планируется выполнять не в ближайшее время, а позже, то ткани с целью сохранения структуры заливают спиртом, раствором формалина или осмиевой кислотой. Что касается твердых материй, то их тщательно размягчают.

Результаты анализа

Гистологический метод исследования имеет высокую точность. Это обусловлено тем, что ткани пораженного органа изучаются под микроскопом, а не рассматриваются сквозь другие ткани и органы, как это происходит во время рентгена или ультразвукового исследования. Именно по этой причине гистологический анализ считается наиболее важным для постановки итогового диагноза. Кроме этого, благодаря микроскопии и обязательному окрашиванию тканей пациента специалисты имеют возможность получить самые точные данные о текущем состоянии пораженного органа. Зная утвержденные стандарты структуры тканей и внутренних органов в здоровом состоянии, врач легко может провести оценку патологических изменений и оперативно установить наличие заболевания, а также его степень.

По результатам исследования специалист дает заключение. В нем может стоять ориентировочный или заключительный диагноз, а в ряде случаев дается только описательный ответ, позволяющий высказать лишь предположение о характере патологии (при недостаточности клинических сведений или материала).

Ориентировочный диагноз дает возможность определить круг заболеваний для выполнения дифференциального исследования, а заключительный ответ выступает основой для формулировки клинического диагноза.

Ошибочные данные

Многих пациентов интересует вопрос о том, могут ли быть получены ошибочные результаты при гистологическом исследовании. Такое случается, как правило, если врач неверно выполнил забора биоматериала. Например, взял много здоровых тканей, а пораженный участок органа практически полностью пропустил. Также причиной ошибки могут стать неправильные условия хранения тканей больного или же серьезные нарушения, допущенные во время их подготовки к хранению.

Помимо этого, для получения достоверного результата огромное значение имеет количество срезов - чем их будет больше, тем лучше, поскольку если срезов недостаточно, пораженный участок ткани можно и пропустить, в таком случае тщательного изучения не будет проведено.

Нередко ошибки при осуществлении такой диагностики объясняются недостаточной квалификацией гистолога и отсутствием взаимопонимания между ним и врачом, производящим лечение больного.

Гистологические исследования в гинекологии

В этой отрасли медицины рассматриваемый метод диагностики имеет большое значение. В гинекологии нашли свое применение все гистопатологические виды исследования. Их использование дает возможность установить диагноз с наибольшей степенью достоверности в случае различных патологий женской репродуктивной системы. Особо важную роль играет гистологическое исследование матки, ее придатков, а также шейки матки. Такая диагностика позволяет выявлять онкологические заболевания, а также определять причины замерших беременностей и самопроизвольных выкидышей.

Гистологическое исследование эндометрия

Такой вариант диагностики в гинекологии дает возможность правильно оценить функционирование яичников и своевременно выявить любые патологические процессы, происходящие в них. Если у женщины еще продолжается менструальный цикл, гистологическое исследование эндометрия осуществляют примерно за три дня до начала очередных месячных. В том случае если у пациентки имеют место дисфункциональные кровотечения, соскоб требуется брать непосредственно во время кровотечения.

Полученные посредством диагностического выскабливания биологические ткани для проведения исследования окрашивают при помощи гематоксилина или эозина. В некоторых случаях применяется методика Ван Гизона. После окрашивания путем анализа определяют строение стромы и желез, выявляют все особенности эндометрия. Во время лютеиновой фазы менструального цикла здоровые железы отличаются пиловидной формой, они слегка расширены. Сами клетки железистого эпителия при этом имеют светлую цитоплазму и бледные ядра, а в железах в обязательном порядке обнаруживается секрет.

Гистология шейки матки

Диагностика проводится путем забора из нижнего сегмента детородного органа небольшого количества тканей. Если при проведении анализа в них обнаруживаются незначительные патологические изменения, то можно утверждать о наличии у пациентки доброкачественного образования или воспалительного заболевания. В том случае если клеток с патологическими изменениями выявлено много, говорят о развитии злокачественной опухоли или предраковом состоянии.

Гистология матки

Гистологическое исследование детородного органа осуществляется исключительно по показаниям. Такая диагностика выполняется, если, к примеру, женщину мучают боли в нижней части живота или у нее наблюдаются длительные маточные кровотечения, если выявляется опухолевое образование при прощупывании живота и так далее.

Биологический материал берется для исследования во время диагностической гистероскопии - это малоинвазивное обследование внутренней поверхности детородного органа посредством гистероскопа - специального оптического прибора. Надо отметить, что процедура является довольно сложной, осуществляется зачастую под общим наркозом (в редких случаях применяют местное обезболивание). Инструментами, входящими в состав гистероскопа, специалист берет кусочки ткани, которые затем отправляются на гистологическое исследование, в ходе которого можно точно установить, что послужило причиной неприятных симптомов. Такая диагностика также позволяет отличить доброкачественное образование (к примеру, миому) от злокачественного.

Гистология яичников

В этом случае забор биологического материала для гистологического анализа выполняют посредством пункционной биопсии (делают прокол передней брюшной стенки). В настоящее время такая процедура осуществляется под контролем ультразвукового исследования - это дает возможность получить ткань непосредственно из тех участков, которые вызывают подозрение. Проведение такой диагностики позволяет отличить доброкачественную опухоль и кисту от рака яичника.

Для прогресса гистологии, цитологии и эмбриологии большое значе­ние имеет внедрение достижений физики и химии, новых методов смеж­ных наук - биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии.

Современные методы исследования позволяют изучать ткани не только как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для изуче­ния их жизнедеятельности в течение длительного времени, выделять отдель­ные клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы (например, ДНК), исследовать их функциональные особенности.

Такие возможности открылись в связи с созданием новых приборов и технологий - различных типов микроскопов, компьютерной техники, рен-тгеноструктурного анализа, применения метода ядерно-магнитного резо­нанса (ЯМР), радиоактивных изотопов и авторадиографии, электрофореза и хроматографии, фракционирования клеточного содержимого с помощью ультрацентрифугирования, разделения и культивирования клеток, получе­ния гибридов; использования биотехнологических методов - получения гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.

Таким образом, биологические объекты можно изучать на тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Несмотря на внедрение в естественные науки разнообразных биохимических, биофизических, фи­зических и технологических методов, необходимых для решения многих вопросов, связанных с жизнедеятельностью клеток и тканей, гистология в основе своей остается морфологической наукой со своим набором методов. Последние позволяют охарактеризовать процессы, происходящие в клетках и тканях, их структурные особенности.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа явля­ются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микро­скопе, применение методов микроскопирования, качественный и количе­ственный анализ изображений.

Объектами исследования служат живые и фиксированные клет­ки и ткани, их изображения, полученные в световых и электронных мик­роскопах или на телевизионном экране дисплея. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных объектов.

Методы микроскопирования гистологических препаратов

Основными методами изучения биологических микрообъектов являют­ся световая и электронная микроскопия, которые широко используют"ся в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование - основной метод изучения микрообъектов, ис­пользуемый в биологии более 300 лет. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические си­стемы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d o ), которое в основном зависит от длины волны света (\) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется фор­мулой d 0 = 1 / 2 \. Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате. Для изучения гистологических препаратов при­меняют разнообразные виды световых микроскопов и электронные мик­роскопы.

Рис. 1. Микроскопы для биологичес­ких исследований.

А - световой биологический микроскоп «Биолам-С»: 1 - основание; 2 - тубусо-держатель; 3 - наклонный тубус; 4 - оку­ляр, 5 - револьвер; 6 - объективы; 7 - столик; 8 - конденсор с ирисовой диаф­рагмой; 9 - винт конденсора; 10 - зерка­ло; 11 - микрометрический винт; 12 - макрометрический винт. Б - электронный микроскоп ЭМВ-100АК с автоматизиро­ванной системой обработки изображений: 1 - колонка микроскопа (с электронно-оптической системой и камерой для образ­цов); 2 - пульт управления; 3 - камера с люминесцентным экраном; 4 - блок ана­лиза изображений; 5 - датчик видеосигна­ла.

Световая микроскопия. Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В обычных све­товых микроскопах источником освещения служит естественный или ис­кусственный свет (рис. 1, А). Минимальная длина волны видимой части спектра равна примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм (d o = "/,- 0,4 мкм = 0,2 мкм), а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500-2500.

Таким образом, в световом микроскопе можно видеть не только отдель­ные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структу­ры - органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

Ультрафиолетовая микроскопия . Это разновидность световой микроско­пии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафи­олетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет при­близительно 0,1 мкм (d o = V 2 - 0,2 мкм = 0,1 мкм). Полученное в ультрафи­олетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специаль­ных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобра­зователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресцен­ции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный пе­реход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испускани­ем света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксеноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие вы­сокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолето­вые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэто­му их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первич­ную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехолами-ны (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80 °С (ме­тод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами.

Существуют различные флюорохромы, которые специфически связы­ваются с определенными макромолекулами (акридин оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов чаще всего упот­ребляется флюорохром акридиновый оранжевый. В этом случае ДНК и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные - ярко-красное свечение. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом со­ставе. Вариант метода флюоресцентной микроскопии, при котором и воз­буждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцент­ной микроскопии .

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, неви­димых при обычных методах микроскопирования. Как уже указывалось, в обычном световом микроскопе необходимая контрастность структур дости­гается с помощью окрашивания. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной коль­цевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики микроско­па дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контра­ста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю прелом­ления. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнополъного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию структур в препарате, достигает объектива. Про­исходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя на­правляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие части­цы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Разре­шение этого микроскопа не может быть лучше, чем у светлопольного мик­роскопа, так как используется такая же длина волны. Но здесь достигается больший контраст. Он используется для изучения живых объектов, автора­диографических объектов, например зерен серебра, которые выглядят свет­лыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частно­сти treponema pallidum , вызывающей сифилис и др.

Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани, и диффе­ренциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который специально используют для изучения рельефа по­верхности клеток и других биологических объектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделя­ется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колеба­ния, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяют­ся и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возника­ющий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в про­цессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки.

Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляри­зационных фильтра - первый (поляризатор) между пучком света, и объек­том, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Через пер­вый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось, которая располагается перпендикулярно первому филь­тру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Оба фильт­ра могут вращаться, изменяя направление пучка света. Если анализатор повернуть на 90° по отношению к поляризатору, то свет проходить через них не будет. Структуры, содержащие продольно ориентированные молеку­лы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллическиеструктуры (в клетках Лейдига 1) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образо­ваний к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикуляр­ную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью об­ладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

Электронная микроскопия. Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии были создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 1, Б). В электронном микроскопе используется поток электронов с бо­лее короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. При напряже­нии 50 000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рас­считано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т.е. в 100 000 раз меньше; чем в световом мик­роскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешае­мое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время широко используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и ска­нирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ). С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучае­мого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает» остро сфокусированным электронным пучком отдельные точ­ки поверхности. Для исследования выбранного участка микрозонд двигает­ся по его поверхности под действием отклоняющих катушек (принцип те­левизионной развертки). Такое исследование объекта называется сканиро­ванием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, - растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являют­ся большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

Электронная микроскопия по методу замораживания - скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготов­ления сколов клетки замораживают при низкой температуре (-160 °С). При иссле­довании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (око­ло 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160 С С.

Метод электронной микроскопии «замораживание - травление» применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующие­ся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания - скалывания и замораживания - травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них арте­фактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют ис­следовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы - ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криоультра-микротомии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196 °С. Это обеспечива­ет торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности фер­ментов, а также для проведения иммунохимических реакций. Для выявления анти­генов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализа­цию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроско­пы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм), так как при высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стерео­скопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

Рентгеноструктурный анализ. Для изучения структуры макромолекул на ато­марном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину волны около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Молекулы, образующие крис­таллическую решетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые регист­рируют на фотопластинке в виде множества пятен различной интенсивности. Интен­сивность пятен зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. Положение пятен в дифракционной картине зависит от положения объек­та в системе, а их интенсивность свидетельствует о его внутренней атомной структуре.

Методы исследования фиксированных клеток и тканей

Исследование фиксированных клеток и тканей. Основным объектом ис­следования являются гистологические препараты, приготовленные из фик­сированных структур. Препарат может представлять собой мазок (напри­мер, мазок крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозго­вой оболочки), тонкий срез. Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без спе­циальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют"слабый контраст, они плохо выявля­ются в обычном световом микроскопе и требуется использование специаль­ных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и элек­тронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация, 2) уплотнение материала, 3) приготовление срезов, 4) окрашивание или контрастирование срезов. Для световой мик­роскопии необходим еще один этап - заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды (5). Фиксация обеспечивает предотвращение про­цессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмие­вая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают терми­ческой обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фик­сированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей.

Уплотнение кусочков, необходимое для приготовления срезов, произво­дится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала пара­фином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов производится на специальных приборах - микро­томах (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии).

Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их соля­ми металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения кон­трастности изображения отдельных структур при рассматривании их в мик­роскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования. Гистологические краси­тели подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее известный основной краситель азур II , который окрашивает ядра в фиолетовый цвет, и кислый краситель - эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-оранжевый цвет. Избиратель­ное сродство структур к определенным красителям обусловлено их хими­ческим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окраши­вающиеся кислыми красителями, называются оксифильными (ацидофильны­ми, эозинофильными), а окрашивающиеся основными - базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, яв­ляются нейтрофилъными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обез­воженный гистологический срез заключают между предметным и по­кровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гис­тологический препарат может быть использован для изучения под микро­скопом в течение многих лет. Для электронной микроскопии срезы, полу­ченные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрас­тируют солями марганца, кобальта и др., после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объек­том изучения наряду с гистологическими препаратами.

Методы исследования живых клеток и тканей

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности - проследить движение, процессы деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток, продолжительность их жизненного цикла, реактивные изменения в ответ на действие различных факторов.

Прижизненные исследования клеток в организме (in vivo ). Одним из при­жизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме. С помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюми­наторов, например, можно изучать в динамике циркуляцию крови в мик­рососудах. После проведения анестезии у животного объект исследования (например, брыжейка кишечника) выводят наружу и рассматривают в мик­роскопе, при этом ткани должны постоянно увлажняться изотоническим раствором натрия хлорида. Однако длительность такого наблюдения огра­ничена. Лучшие результаты дает метод вживления прозрачных ка­мер в организм животного.

Наиболее удобным органом для вживления таких камер и последующего на­блюдения является ухо какого-либо животного (например, кролика). Участок уха с прозрачной камерой помещают на предметный столик микроскопа и в этих услови­ях изучают динамику изменения клеток и тканей в течение продолжительного вре­мени. Таким образом могут изучаться процессы выселения лейкоцитов из кровенос­ных сосудов, различные стадии образования соединительной ткани, капилляров, нервов и другие процессы. В качестве естественной прозрачной камеры можно ис­пользовать глаз экспериментальных животных. Клетки, ткани или образцы органов помещают в жидкость передней камеры глаза в угол, образованный роговицей и радужкой, и могут наблюдаться через прозрачную роговицу. Таким образом была произведена трансплантация оплодотворенной яйцеклетки и прослежены ранние стадии развития зародыша. Обезьянам были пересажены небольшие кусочки матки и изучены изменения слизистой оболочки матки в различные фазы менструального цикла.

Широкое применение нашел метод трансплантации клеток кро­ви и костного мозга от здоровых животных-доноров животным-реципиен­там, подвергнутым смертельному облучению. Животные-реципиенты после трансплантации оставались живыми вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток. Исследова­ние числа колоний и их клеточного состава позволяет выявлять количество родоначальных кроветворных клеток и различные стадии их дифференци­ровки. С помощью метода колониеобразования установлены источники раз­вития для всех клеток крови.

Витальное и суправитальное окрашивание. При витальном (прижиз­ненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм жи­вотного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточное вещество. Например, с помощью трипанового синего или литиевого кармина выявляют фагоциты, а с помощью ализа­рина - новообразованный матрикс кости.

Суправитальным окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом выявляют молодые фор­мы эритроцитов - ретикулоциты крови (краситель бриллиантовый крези-ловый голубой), митохондрии в клетках (краситель зеленый янус), лизосомы (краситель нейтральный красный).

Исследования живых клеток и тканей в культуре (in vitro ). Этот метод является одним из самых распространенных. Выделенные из организма че­ловека или животных клетки, маленькие образцы тканей или органов по­мещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду, - плазму крови, эмбриональный экстракт, а так­же искусственные среды. Различают суспензионные культуры (клет­ки взвешены в среде), тканевые, органные и монослойные культуры (эксплантированные клетки образуют на стекле сплошной слой). Обеспечи­ваются стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют ос­новные показатели жизнедеятельности - способность к росту, размноже­нию, дифференцировке, движению. Такие культуры могут существовать многие дни, месяцы и даже годы, если обновлять среду культивирования и пересаживать жизнеспособные клетки в другие сосуды. Некоторые виды клеток благодаря изменениям в их геноме могут сохраняться и размножать­ся в культуре, образуя непрерывные клеточные линии. В разработку методов культивирования клеток и тканей большой вклад внесли А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Н. Г. Хлопин, А. Д. Тимофеевский, Ф. М. Лазаренко. В на­стоящее время получены клеточные линии фибробластов, миоцитов, эпи-телиоцитов, макрофагов и др., которые существуют многие годы.

Использование метода культивирования позволило выявить ряд зако­номерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, клеточных взаимодействий, взаимодействий клеток с вирусами и микроба­ми. Показана возможность хрящевых клеток формировать в культуре меж­клеточное вещество и способность клеток надпочечников продуцировать гормоны. Культивирование эмбриональных тканей и органов дало возмож­ность проследить развитие кости, кожи и других органов. Разработана мето­дика культивирования нервных клеток.

Особую значимость метод культуры тканей имеет для проведения эк­спериментальных наблюдений на клетках и тканях человека. Взятые из организма человека клетки при пункции или биопсии могут в культуре тканей использоваться для определения пола, наследственных заболева­ний, злокачественного перерождения, выявления действия ряда токсич­ных веществ.

В последние годы клеточные культуры широко применяются для гиб­ридизации клеток.

Разработаны методы разделения тканей на клетки, выделение отдельных типов клеток и их культивирования.

Вначале ткань превращают в суспензию клеток путем разрушения межклеточных контактов и межклеточного матрикса с помощью протеолитических ферментов (трип­син, коллагеназа) и соединений, связывающих Са 2+ (с помощью ЭДТА - этиленди-аминтетрауксусной кислоты). Далее полученную суспензию разделяют на фракции клеток различных типов с помощью центрифугирования, позволяющего отделить более тяжелые клетки от легких, большие от малых, или путем прилипания клеток к стеклу или пластмассе, способность к которому у различных типов клеток неодина­кова. Для обеспечения специфического прилипания клеток к поверхности стекла ис­пользуют антитела, специфически связывающиеся с клетками одного типа. Прилип­шие клетки затем отделяют, разрушая матрикс ферментами, при этом получают взвесь однородных клеток. Более тонким методом разделения клеток является мече-ние антителами, связанными с флюоресцирующими красителями. Меченые клетки отделяются от немеченых с помощью сортера (электронного флюоресцентно-активи­руемого клеточного анализатора). Клеточный анализатор сортирует в 1 с около 5000 клеток. Выделенные клетки можно изучать в условиях культивирования.

Метод культивирования клеток позволяет изучать их жизнедеятельность, раз­множение, дифференцировку, взаимодействие с другими клетками, влияние гор­монов, факторов роста и др.

Культуры обычно готовят из суспензии клеток, полученной вышеописанным методом диссоциации ткани. Большинство клеток неспособны расти в суспензии, им необходима твердая поверхность, в качестве которой используют поверхность пластиковой культуральной чашки, иногда с компонентами внеклеточного матрик-са, например коллагена. Первичными культурами называют культуры, приготовлен­ные непосредственно после первого этапа фракционирования клеток, вторичны­ми - культуры клеток, пересаженные из первичных культур в новую среду. Можно последовательно перевивать клетки в течение недель и месяцев, при этом клетки сохраняют характерные для них признаки дифференцировки (например, клетки эпителия образуют слои). Исходным материалом для клеточных культур обычно слу­жат эмбриональные ткани и ткани новорожденных.

В качестве питательных сред используют смеси солей, аминокислот, витами­нов, лошадиной сыворотки, экстракт куриных эмбрионов, эмбриональную сыво­ротку и др. В настоящее время разработаны специальные среды для культивирова­ния различных типов клеток. Они содержат один или несколько белковых факторов роста, необходимых клеткам для жизнедеятельности и размножения. Например, для роста нервных клеток необходим фактор роста нервов (ФРН).

У большинства клеток в культуре наблюдается определенное число делений (50-100), а затем они погибают. Иногда в культуре появляются мутантные клетки, которые размножаются бесконечно и образуют клеточную линию (фибробласты, эпителиоциты, миобласты и др.). Мутантные клетки отличаются от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, но могущих расти без прикрепления к твердой поверхности. Раковые клетки в культуральных чашках образуют более плот­ную популяцию, чем популяции обычных клеток. Аналогичное свойство можно вызвать экспериментально у нормальных клеток путем трансформации их опухоле-родными вирусами или химическими соединениями, при этом образуются неопла-стически трансформированные клеточные линии. Клеточные линии нетрансформи-рованных и трансформированных клеток можно длительно сохранять при низких температурах (-70 °С). Генетическую однородность клеток усиливают клонировани­ем, когда из одной клетки при ее последовательном делении получают большую колонию однородных клеток. Клон - это популяция клеток, происходящих из од­ной клетки-предшественника.

Клеточные гибриды. При слиянии двух клеток различных типов образу­ется гетерокарион - клетка с двумя ядрами. Для получения гетерока-риона суспензию клеток обрабатывают полиэтиленгликолем или инактиви-рованными вирусами для повреждения плазмолемм клеток, после чего клет­ки способны к слиянию. Например, неактивное ядро эритроцита курицы становится активным (синтез РНК, репликация ДНК) при слиянии кле­ток и переносе в цитоплазму другой клетки, растущей в культуре ткани. Ге­терокарион способен к митозу, в результате чего образуется гибридная клет­ка. Оболочки ядер у гетерокариона разрушаются, и их хромосомы объеди­няются в одном большом ядре.

Клонирование гибридных клеток приводит к образованию гибридных клеточных линий, которые используются для изучения генома. Например, в гибридной клеточной линии «мышь - человек» установлена роль хромо­сомы 11 человека в синтезе инсулина.

Гибридомы. Клеточные линии гибридом используют для получения мо-ноклональных антител. Антитела вырабатываются плазмоцитами, которые образуются из В-лимфоцитов при иммунизации. Определенный вид анти­тел получают при иммунизации мышей конкретными антигенами. Если клонировать такие иммунизированные лимфоциты, то можно получить большое количество однородных антител. Однако время жизни В-лимфоци­тов в культуре ограничено. Поэтому производят их слияние с «бессмертны­ми» опухолевыми клетками (В-лимфомы). В результате образуются гибридо мы (гибрид-клетка, с геномом от двух разных клеток; ома - окончание в названиях опухолей). Такие гибридомы способны размножаться длительно в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Каждый клон гиб­ридомы является источником моноклональных антител. Все молекулы анти­тел данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания анти­генов. Можно получать моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке, и использовать их для установления локализации белков в клетке, а также для выделения белка из смеси (очистка белков), что позволяет исследовать структуру и функцию белков. Моноклональные антитела применяют также в технологии клонирования генов.

Антитела можно использовать для изучения функции различных моле­кул, вводя их через плазмолемму непосредственно в цитоплазму клеток тонкой стеклянной пипеткой. Например, введение антител к миозину в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки морского ежа останавливает раз­деление цитоплазмы.

Технология рекомбинантных ДНК. Классические генетические методы позволяют изучать функцию генов, анализируя фенотипы мутантных орга­низмов и их потомства. Технология рекомбинантных ДНК дополняет эти методы, позволяет проводить детальный химический анализ генетического материала и получать в больших количествах клеточные белки.

Методы гибридизации широко используют в современной биологии для изучения структуры генов и их экспрессии.

Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей

Для изучения химического состава биологических структур - локали­зации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма при­меняют специальные методы исследования.

Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять лока­лизацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и ор­ганов - ДНК, РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минераль­ных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, вхо­дящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для повышения специфичности реакции часто при­меняют ферментативный контроль. Например, для выявления в клетках ри­бонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин - краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обра­боткой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеа­зой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверж­дает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочислен­ных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.

В последние годы сочетание гистохимических методов с методом элек­тронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направ­ления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать ло­кализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях.

Для изучения макромолекул клеток используют очень чувствительные методы с применением радиоактивных изотопов и антител, позволяющие обнаружить даже небольшое содержание молекул (менее 1000).

Радиоактивные изотопы при распаде ядра испускают заряженные части­цы (электроны) или излучение (например, гамма-лучи), которые можно зарегистрировать в специальных приборах. Радиоактивные изотопы исполь­зуют в методе радиоавтографии. Например, с помощью радиоизотопов 3 Н-тимидина исследуют ДНК ядра, с помощью 3 Н-уридина - РНК.

Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в разных структурах. В основе метода лежит исполь­зование радиоактивных элементов (например, фосфора - 32 Р, углерода - 14 С, серы - 35 S , водорода - 3 Н) или меченных ими соединений. Радиоак­тивные вещества в гистологических срезах обнаруживают с помощью фото­эмульсии, которую наносят на препарат и затем проявляют. В участках пре­парата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, про­исходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участ­ки (треки). Этим методом можно определять, например, скорость включе­ния меченых аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, об­мен йода в клетках щитовидной железы и др.

Методы иммунофлюоресцентного анализа. Применение антител. Антите­ла - защитные белки, вырабатываемые плазмоцитами (производными В-лимфоцитов) в ответ на действие чужеродных веществ (антигенов). Ко­личество различных форм антител достигает миллиона. Каждое антитело имеет участки для «узнавания» молекул, вызвавших синтез этого антитела. В связи с высокой специфичностью антител в отношении антигенов они могут быть использованы для выявления любых белков клетки. Для выявле­ния локализации белков антитела окрашивают флюоресцирующими краси­телями, а затем клетки изучают с помощью флюоресцентной микроскопии. Антитела можно использовать также для изучения антигенов на ультра­структурном уровне с помощью электронного микроскопа. Для этого анти­тела метят электронно-плотными частицами (микросферы коллоидного зо­лота). Для усиления специфичности реакции применяют моноклональные антитела, образуемые линией клеток, - клонами, полученной методом гибридом из одной клетки. Метод гибридом позволяет получать монокло­нальные антитела с одинаковой специфичностью и в неограниченных ко­личествах.

Методы иммунофлюоресцентного анализа широко и эффективно ис­пользуются в современной гистологии. Эти методы применяются для изуче­ния процессов дифференцировки клеток, выявления в них специфических химических соединений и структур. Они основаны на реакциях антиген - антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный со­став, который главным образом определяется белками. Продукты реакции можно окрашивать и выявлять в люминесцентном микроскопе, например выявление актина и тубулина в клетке с помощью метода иммунофлюорес­центного анализа (см. главу IV ).

Современные методы исследований позволяют проводить анализ хими­ческого состава различных структурных компонентов клеток, как фиксиро­ванных, так и живых. Изучение отдельных внутриклеточных структур стало возможным после разработки технологий фракционирования клеточного содержимого.

Фракционирование клеточного содержимого

Фракционировать структуры и макромолекулы клеток можно различны­ми методами - ультрацентрифугированием, хроматографией, электрофо­резом. Подробнее эти методы описаны в учебниках биохимии.

Ультрацентрифугирование. С помощью этого метода клетки можно разделить на органеллы и макромолекулы. Вначале разрушают клет­ки осмотическим шоком, ультразвуком или механическим воздействием. При этом мембраны (плазмолемма, эндоплазматический ретикулум) распадаются на фрагменты, из которых формируются мельчайшие пу­зырьки, а ядра и органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и пероксисомы) сохраняются интактными и находятся в образующей сус­пензии.

Для разделения вышеуказанных компонентов клетки применяют высо­коскоростную центрифугу (80 000-150 000 оборотов/мин). Вначале оседают (седиментируют) на дне пробирки более крупные части (ядра, цитоскелет). При дальнейшем увеличении скоростей центрифугирования надосадочных фракций последовательно оседают более мелкие частицы - сначала мито­хондрии, лизосомы и пероксисомы, затем микросомы и мельчайшие пу­зырьки и, наконец, рибосомы и крупные макромолекулы. При центрифу­гировании различные фракции оседают с различной скоростью, образуя в пробирке отдельные полосы, которые можно выделить и исследовать. Фрак­ционированные клеточные экстракты (бесклеточные системы) широко ис­пользуют для изучения внутриклеточных процессов, например для изуче­ния биосинтеза белка, расшифровки генетического кода и др.

Хроматография широко используется для фракционирования бел­ков.

Электрофорез позволяет разделить белковые молекулы с различным зарядом при помещении их водных растворов (или в твердом пористом матриксе) в электрическом поле.

Методы хроматографии и электрофореза применяют для анализа пеп­тидов, получаемых при расщеплении белковой молекулы, и получения так называемых пептидных карт белков. Подробно эти методы описаны в учеб­никах биохимии.

Изучение химического состава живых клеток. Для изучения распределе­ния веществ и их метаболизма в живых клетках используют методы ядерно­го магнитного резонанса и микроэлектродную технику.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) позволяет изучать малые моле­кулы низкомолекулярных веществ. Образец ткани содержит атомы в различных мо­лекулах и в различном окружении, поэтому он будет поглощать энергию на различ­ных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для дан­ного образца составит его спектр ЯМР. В биологии сигнал ЯМР от протонов (ядер водорода) широко используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и др. Для изучения макромолекул внутри живой клетки часто применяют изотопы 3 Н, 13 С, 35 К, 31 Р для получения сигнала ЯМР и слежения за его изменением в процессе жиз­недеятельности клетки. Так, 3| Р используется для изучения мышечного сокращения - изменений содержания в тканях АТФ и неорганического фосфата. Изотоп 13 С по­зволяет с помощью ЯМР исследовать многие процессы, в которых участвует глю­коза. Использование ЯМР ограничено его низкой чувствительностью: в 1 г живой ткани должно содержаться не менее 0,2мм исследуемого вещества. Преимуществом метода является его безвредность для живых клеток.

Микроэлектродная техника. Микроэлектроды представляют собой стеклянные трубочки, заполненные электропроводным раствором (обычно раствор КС1 в воде), диаметр конца которых измеряется долями микрона. Кончик такой тру­бочки можно вводить в цитоплазму клетки через плазмолемму и определять кон­центрацию ионов Н + , Na + , К + , С1", Са 2+ , Mg 2+ , разность потенциалов на плазмо-лемме, а также производить инъекцию молекул в клетку. Для определения концен­трации конкретного иона используют ионселективные электроды, которые запол­няют ионообменной смолой, проницаемой только для данного иона. В последние годы микроэлектродную технику применяют для изучения транспорта ионов через специальные ионные каналы (специализированные белковые каналы) в плазмолем-ме. При этом используют микроэлектрод с более толстым кончиком, который плот­но прижимают к соответствующему участку плазмолеммы. Этот метод позволяет ис­следовать функцию одиночной белковой молекулы. Изменение концентрации ионов внутри клетки можно определить с помощью люминесцирующих индикаторов. На­пример, для изучения внутриклеточной концентрации Са 2+ используют люминес­центный белок акварин (выделен из медузы), который излучает свет в присутствии ионов Са 2+ и реагирует на изменение концентрации последнего в пределах 0,5- 10 мкМ. Синтезированы также флюоресцентные индикаторы, прочно связывающи­еся с Са 2+ . Создание различных новых типов внутриклеточных индикаторов и совре­менных способов анализа изображений позволяет точно и быстро определять внут­риклеточную концентрацию многих низкомолекулярных веществ.

Количественные методы

В настоящее время наряду с качественными методами разработаны и применяются количественные гистохимические методы опре­деления содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность количественно-гистохимических (в отличие от биохимических) методов исследования заключается в возможности изучения концентрации и содер­жания химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей.

Цитоспектрофотометрия - метод количественного изучения внутрикле­точных веществ по их абсорбционным спектрам.

Цитоспектрофлюориметрия - метод количественного изучения внутри­клеточных веществ по спектрам их флюоресценции или по интенсивности флюоресценции на одной заранее выбранной волне (цитофлюориметрия).

Современные микроскопы - цитофлюориметры позволяют обнаружить в различных структурах малые количества вещества (до 10~ 14 -10~ 16 г) и оце­нить локализацию исследуемых веществ в микроструктурах.

Методы анализа изображения клеточных и тканевых структур

Полученные изображения микрообъектов в микроскопе, на телевизи­онном экране дисплея, на электронных микрофотографиях могут подвер­гаться специальному анализу - выявлению морфометрических, денситомет-рических параметров и их статистической обработке.

Морфометрические методы позволяют определять с помощью специаль­ных сеток (Е. Вейбеля, А. А. Глаголева, С. Б. Стефанова) число любых структур, их площади, диаметры и др. В частности, в клетках могут быть измерены площади ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазмати-ческие отношения и др. Существуют ручная морфометрия и авто­матизированная морфометрия, при которой все параметры изме­ряются и регистрируются в приборе автоматически.

В последние годы все большее распространение получают автоматизи­ рованные системы обработки изображений (АСОИз), позволяющие наиболее эффективно реализовать перечисленные выше количественные методы для изучения клеток и тканей. При этом аналитические возможности количе­ственной микроскопии дополняются методами анализа и распознавания образцов, основанными на обработке с помощью электронных вычисли­тельных машин (ЭВМ) информации, извлекаемой из изображений клеток и тканей. По существу можно говорить об устройствах, не только усилива­ющих оптические возможности зрительного анализатора человека, но и многократно расширяющих его аналитические возможности. Высказывается мнение, что АСОИз совершает такой же переворот в морфологии, какой около 300 лет назад произошел благодаря изобретению светового, а около 50 лет назад - электронного микроскопа, поскольку они не только неиз­меримо повышают производительность труда исследователя и не только объективизируют наблюдения, но и позволяют получать новую информа­цию о невыявляемых ранее процессах, численно моделировать и прогнози­ровать их развитие в клетках и тканях.

Вместе с тем участие в эксперименте ЭВМ требует от исследователя нового подхода к его проведению, владения навыками составления алго­ритмов процесса исследования, точности рассуждений и в конечном итоге повышения научно-методического уровня исследования.

Одним из методов, существенно расширивших число решаемых морфо­логических задач, является оптико-структурный машинный анализ (ОСМА), предложенный в 1965 г. К.М.Богдановым. В 1978 г. автор метода был удосто­ен Государственной премии СССР. С появлением ОСМА сделан качествен­но новый шаг в разработке единой методологии количественного анализа микроструктур на основе статистических характеристик. В последнее время ОСМА нашел эффективное применение в исследовательской практике и народном хозяйстве.

На рис. 2 представлена созданная в нашей стране фирмой «ЛОМО» ав­томатизированная система обработки изображений «Протва-МП». Система предназначена для проведения комплексных исследований клеток и тканей с использованием методов абсорбционной, флюоресцентной микроскопии и радиоавтографии.

Входящий в состав системы специальный сканирующий оптический или электронный микроскоп осуществляет последовательный просмотр изображения препарата по двум координатам, преобразуя его в цифровую форму, и вводит в ЭВМ, которая в свою очередь производит цифровую обработку изображения и выдает информацию о геометрических и других характеристиках анализируемого объекта.

С помощью цветного дисплея исследователь может «препарировать» изображе­ние, выделяя лишь те структурные составляющие, которые его интересуют. Входя­щие в состав ЭВМ емкие накопители информации на магнитных дисках или лентахпозволяют запоминать как сами изображения, так и результаты их обработки для последующего хранения и документирования

Использование методов автоматизированного анализа микрообъектов рассмотрим на примере обработки изображения лейкоцита крови (рис 3) Сканирующий микроскоп-фотометр позволяет построчно «просматривать» значения оптической плотности с шагом, заданным исследователем В ре­зультате оптический сигнал, соответствующий оптической плотности объекта, преобразуется в цифровую форму Полученная цифровая матри­ца подлежит препаровке с помощью специального математического аппа­рата

Вначале убирается фон и вычленяется «чистый» объект - изображение клетки (1а), затем из изображения клетки выделяется любая интересующая исследователя деталь, например цитоплазма (16) и ядро (I порядка среднее и ин­тегральное значение оптической плотности, дисперсия, асимметрия, эксцесс и др По изображению объекта получают морфометрические параметры пло­щадь, периметр, диаметр, ядерно-цитоплазматическое отношение, коэффициент формы и др

Следующим этапом обработки изображения является построение двухмер­ных диаграмм взаимозависимости оптической плотности для всей клетки (см рис 3), ее цитоплазмы (Шб) и ядра (Шв) Так же, как и в первом случае, на диа­грамме всей клетки (Ша) можно выделить фазу цитоплазмы и ядра Данные диа­граммы позволяют рассчитать гистограммные параметры II порядка гомоген­ность, локальный контраст, энтропию и др.

Рис. З. Автоматизированная обработка изображения клетки (схема).

Изображение лейкоцита (а), его цитоплазмы (б) и ядра (в). I - цифровое изображение; II - гистограммы оптической плотности; III - двухмерные гистограммы зависимости значений оптической плотности.

Полученные таким образом параметры представляют многомерный «портрет» клетки и имеют конкретное числовое выражение. Они могут быть подвергнуты различным методам статистической обработки, позволяют предельно точно классифицировать микрообъекты, выявлять особенности их структуры, необнаруживаемые визуально.

Таким образом, применение новых методов исследований в гистологии, цитологии и эмбриологии позволяет выяснить общие закономерности орга­низации тканей и клеток, структурные основы биохимических процессов, определяющих функцию конкретных структурных компонентов клетки.